饮用水中军团菌检测

１范围
本标准规定了饮用水中军团菌的检测方法。
本标   准   适   用   于   饮   用   水   中   军   团   菌   的   检   测   。   工   业   用   水   和   天   然   水   及   其   沉   淀   物   、沉   积   物   和   粘   土／软   泥   等   相   关样本进行军团菌检测可参考此法。
２规范性引用文件
下列   文   件   中   的   条   款   通   过   本   标   准   的   引   用   而   成   为   本   标   准   的   条   款   。   凡   是   注   日   期   的   引   用   文   件   ，其   随   后   所   有的修   改   单   （不   包   括   勘   误   的   内   容   ）或   修   订   版   均   不   适   用   于   本   标   准   ，然   而   ，鼓   励   根   据   本   标   准   达   成   协   议   的   各   方   研   究是否可使用这些文件的 * 新版本。凡是不注日期的引用文件，其 * 新版本适用于本标准。
ＧＢ／Ｔ２７４０３实   验   室   质   量   控   制   规   范食品分子生物学检测
ＧＢ／Ｔ２７４０５实   验   室   质   量   控   制   规   范食品微生物检测
ＳＮ／Ｔ１５３８．１培   养   基   制   备   指   南第   １部   分   ：实   验   室   培   养   基   制   备   质   量   保   证   通   则
ＳＮ／Ｔ１５３８．２培   养   基   制   备   指   南第   ２部   分   ：培   养   基   性   能   测   试   实   用   指南
３定义和术语

３．１
下列术语和定义适用于本标准。

军团菌犔犲犵犻狅狀犲犾犪
本细菌为两端钝圆，具有端鞭毛，有动力，无芽孢和荚膜，需氧和兼性厌氧的大小为（０．３ μ ｍ～

０．４ μ ｍ）× （２．０ μ ｍ～３．０ μ ｍ）或（０．５ μ ｍ～０．７ μ ｍ）× （２．０ μ ｍ～２０ μ ｍ）的革兰氏阴性杆菌。
４设备和材料
４．１培养箱：３６ ℃ ± １ ℃ 。
４．２吸管：１ｍＬ、５ｍＬ和１０ｍＬ，分刻度０．１ｍＬ。
４．３接种环：直径３ｍｍ。
４．４天平：感量０．１ｇ。
４．５真空过滤系统。
４．６灭菌平皿：皿底直径９ｃｍ。
４．７浊度仪。
４．８ＰＣＲ扩增仪。
４．９台式离心机：* 高离心力１３０００ｒ／ｍｉｎ。
４．１０低倍双目显微镜。
４．１１恒温水浴锅：３６ ℃ ± １ ℃ 。

４．１２	黑	色	硝	化	纤	维	素	过滤	膜：直径	４７ｍｍ～５０ｍｍ，孔径０．４	５ μ ｍ。Ｍｉｌｉｐｏｒｅ或同类产品。
４．１３	微	量	可	调	移	液	器	。１	μ Ｌ～１０	μ Ｌ，１００ μ Ｌ，２００ μ Ｌ，１０００	μ Ｌ。
４．１４	旋	涡	振	荡	器	。
４．１５	电	泳	仪	。

４．１６凝胶成像分析系统。
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４．１７微波炉。
４．１８玻璃仪器。
５培养基和试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水和培养基配制应符合ＧＢ／Ｔ２７４０５和ＧＢ／Ｔ２７４０３
的规定。
５．１缓冲酵母浸膏琼脂培养基（ＢＣＹＥ）：见附录第Ａ．１章。
５．２缓冲酵母浸膏琼脂培养基（ＢＣＹＥ�Ｃｙｓ）：见附录第Ａ．２章。
５．３选择性培养基（ＧＶＰＣ培养基）：见附录第Ａ．３章。
５．４血平板：见附录第Ａ．４章。
５．５酸缓冲液：见附录第Ａ．５章。
５．６Ｐａｇｅ ’ 盐：见附录第Ａ．６章。
５．７２ × 犜犪狇ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ［０．１Ｕ犜犪狇Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／ μ Ｌ、５００ μ ｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｅａｃｈ、２０ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ� ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１００ｍｏｌ／ＬＫＣｌ、３ｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２］。
５．８ＰＣＲ引物：见表１。
表１军团菌引物序列及扩增片段长度

基因	引物名称	引物序列（５ ’�３ ’）	扩增片段大小／ｂｐ
５ＳｒＲＮＡ	Ｓ１	ＡＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴＴＴＧＧＡＡＣＣＡ	１０４
５ＳｒＲＮＡ	Ｓ２	ＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＴＴＴＣＧＣＡＴ	１０４
Ｍｉｐ	Ｓ３	ＡＴＧＡＴＡＧＣＴＴＡＴＧＡＣＴＧＧＴＡ	９９６
Ｍｉｐ	Ｓ４	ＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＡＴ	９９６

５．９琼脂糖（电泳级）。
５．１０溴化乙锭。
５．１１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ。
５．１２ＴＡＥ电泳储备液（５０ × ）：见附录第Ａ．７章。
５．１３军团菌分型诊断试剂盒。
６检验程序
军团菌检验程序见图１。

图１军团菌的检测程序
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７检验步骤
７．１取样
７．１．１总则
根据   给   水   系   统   和   检   验   目   的   确   定   收   集   样   品   的   体   积   。   要   详   细   记   录   样   品   的   来   源   、体   积   、取   样   时   的   温   度   和   是否含   有   灭   菌   剂   及   其   性   质   ，以   助   于   实   验   室   检   测   。   基   于   安   全   和   分   析   原   因   ，不   要   检   测   未   知   来   源   的   样   品   或   是   冷   却水、过程水，除非这些样品有关于化学添加物的信息，或是在过程中可能存在的污染物的信息。
７．１．２取样容器
用无菌   玻   璃   、聚   乙   烯   或   类   似   容   器   收   集   水   样   品   １０ｍＬ～１０００ｍＬ。   样   品   容   器   的   材   料   也   应   适   用   于   饮   用水。若离试样点较远，使用易碎的玻璃容器不安全的，可使用塑料制品。
７．１．３含生物防腐剂的样品
如果水样含有或是认为含有氧化型灭菌剂时，在取样时或取样前应先使其钝化。
注：对于氯和其他氧化型灭菌剂，可通过加硫代硫酸钾或硫代硫酸钠到容器中钝化。
７．１    ．４样品运输和储存
实   验   室   接   到   水   样   后   应   尽   快   进   行   微   生   物   学   分   析   ， *   好   是   取   样   当   天   ， *   多   不   超   过   ２ｄ。   如   果   是    在    取    样    的    当天   分   析   ，样   品   运   输   时   在   室   温   状   态   下   ，避   免   光   照   就   可   以   了   。   否   则   ，需   在   冷   藏   条   件   ５ ℃ ± ３ ℃ 下   运   输   样   品   。热水样应在取样后直接冷却。
７．２膜过滤
过滤１０ｍＬ～１０００ｍＬ水   样   。   按   照   以   下   步   骤   通   过   酸   缓   冲   液   处   理   样   品   ，以   抑   制   非   军   团   菌   的   生   长   。样品过滤   后   ，加   入   ３０ｍＬ酸   缓   冲   液   ，静   置   ５ｍｉｎ。   膜   过   滤   去   酸   缓   冲   液   ，用   ２０ｍＬＰａｇｅ ’ 盐   或   其   他   洗   液   洗   涤膜。小心地用无菌镊子转移膜，正面向上放置在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ琼脂平板上，确保没有气泡。
７．３培养
倒置平板在３６ ℃ ± １ ℃ 培养２ｄ～１０ｄ。培养期间保持湿润的培养环境。
７．４检查平板
在１０ｄ的培   养   期   间   ，经   常   观   察   。   用   显   微   镜   在   ３ｄ～４ｄ  内   至   少   观   察   两   次   。   记   录   可   疑   军   团   菌   菌   落   的   数量。   军   团   菌   的   生   长   很   可   能   被   其   他   菌   掩   盖   或   抑   制   。   如   果   怀   疑   被   抑   制   ，或   是   有   强   的   生   长   背   景   ，需   重   新   稀   释   样品或   减   少   过   滤   的   样   品   体   积   。在   黑   色   滤   膜   或   黑   色   背   景   下   ，典   型   的   军   团   菌   菌   落   通   常   是   白� 灰� 蓝� 紫   ，但   也   可   能出现棕色、粉色、灰绿色或深红色。军团菌表面光滑，边缘整齐，出现典型的毛玻璃现象。
注：通过膜过滤的军团菌在培养基的生长更加缓慢，且通常菌落比直接在培养基上生长的要小。
７．５可疑军团菌的确证
７．５    ．１犅犆犢犈�犆狔狊的二次培养
在   ＢＣＹＥ或   ＧＶＰＣ平   板   上   次   日   生   长   的   菌   落   均   不   是   军   团   菌   。   从   ＢＣＹＥ或   ＧＶＰＣ平   板   上   选   择   ２ｄ后生长   的   至   少   ５个   可   疑   军   团   菌   菌   落   接   种   到   ＢＣＹＥ和   ＢＣＹＥ�Ｃｙｓ两   块   平   板   上   进   行   二   次   培   养   ，如   果   可   疑   菌落的   形   状   不   同   ，确   保   每   一   形   状   至   少   挑   取   两   个   菌   落   ，３６   ℃ ± １ ℃ 培   养   至   少   ２ｄ。   在    ＢＣＹＥ平   板   上   生   长   而   在ＢＣＹＥ�Ｃｙｓ平板或血平板上不生长的被认为是军团菌。记录每个平板的结果。
７．５．２血清学鉴定
从   ＢＣＹＥ或   ＧＶＰＣ平   板   上   挑   取   可   疑   菌   落   纯   化   后   ，用   多   价   诊   断   血   清   作   玻   片   凝   集   实   验   。   有   条   件   的   可作分型实验。
７．５    ．３犘犆犚检测
７．５    ．３    ．１犘犆犚模板的制备
挑取从ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上可疑纯菌落混于１００ μ Ｌ蒸馏水中，振荡混匀，１００ ℃ 煮沸５ｍｉｎ～
１０ｍｉｎ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液作为模板。
７．５    ．３    ．２多重犘犆犚反应体系和条件
——— 反应体系体积为５０ μ Ｌ：１０ μ ｍｏｌ／Ｌ引物Ｓ１、Ｓ２各１ μ Ｌ，２０ μ ｍｏｌ／Ｌ引物Ｓ３、Ｓ４各５ μ Ｌ；２ ×
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犜犪狇ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５ μ Ｌ；模板ＤＮＡ３ μ Ｌ；ｄｄＨ２Ｏ补足５０ μ Ｌ；
——— 反应条件：９５ ℃ 预变性５ｍｉｎ；９４ ℃ 变性１ｍｉｎ，６０ ℃ 退火１ｍｉｎ，７２ ℃ 延伸１ｍｉｎ，３０个循环，
７２ ℃ 延伸５ｍｉｎ，４ ℃ 保存反应产物。
７．５．３．３犘犆犚质控对照
每次进   行   ＰＣＲ检   测   时   均   需   要   设   置   阳   性   对   照   、阴   性   对   照   和   空   白   对   照   。   其   中   ，用   军   团   菌   标   准   阳   性   菌   株提取   的   ＤＮＡ作   阳   性   对   照   。   用   非   军   团   菌   的   标   准   菌   株   提   取   的   ＤＮＡ作   阴   性   对   照   。   用   灭   菌   双   蒸   水   替   代   模   板作空白对照。
７．５．３．４犘犆犚扩增产物电泳检测
取１．５ｇ琼脂   糖   于   １００ｍＬ电   泳   缓   冲   液   中   加   热   ，充   分   融   化   ，加   入   溴   化   乙   锭   ，使   其   *   终   浓   度   达   到１．０ μｇ／ｍＬ，制胶。在   电   泳   槽   中   加   入   电   泳   缓   冲   液   ，使   液   面   刚   刚   没   过   胶   面   １ｍｍ。取   １０．０ μ ＬＰＣＲ扩   增   产物   点   样   。９Ｖ／ｃｍ恒   压   ，电   泳   ２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ。紫   外   凝   胶   成   像   仪   下   观   察   电   泳   结   果   ，做   好   记   录   。ＰＣＲ扩增产物为１０４ｂｐ、９９６ｂｐ（见表１）。
８结果及报告
８．１当在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上次日生长者，报告未检出军团菌／过滤水的体积。
８．２当在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上不生长，或在   ＢＣＹＥ／ＧＶＰＣ平板上生长而在   ＢＣＹＥ�Ｃｙｓ／血平板上也生长时，报告未检出军团菌／过滤水的体积。
８．３当在   ＢＣＹＥ或   ＧＶＰＣ平   板   上   生   长   而   在   ＢＣＹＥ�Ｃｙｓ或   血   平   板   上   不   生   长   的   ，同   时   血   清   凝   集   实   验   阳性者，报告检出军团菌／过滤水的体积。
８．４当在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上生长，同时ＰＣＲ产物扩增出片段长度为１０４ｂｐ者，报告检出军团菌
（非嗜肺军团菌）／过滤水的体积。
８．５当在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上生长，同时ＰＣＲ产物扩增出片段长度为１０４ｂｐ、９９６ｂｐ两条片断者，
报告检出军团菌（嗜肺军团菌）／过滤水的体积。
８．６定量计算。挑取的可疑菌落经鉴定后，计数方法如下：从ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上计算出在３０个～
３００个之   间   的   可   疑   菌   落   数   （若   超   出   ３００个   要   稀   释   ），从   可   疑   菌   落   中   挑   取   ５个   进   行   确   证   ，若   有   ３个   证   实   是   军团菌   ，则   ３／５乘   以   ＢＣＹＥ或   ＧＶＰＣ平   板   上   在   ３０个   ～３００个   之   间   的   可   疑   菌   落   数   ，即   为   单   位   体   积   的   可   能军团菌数（ＣＦＵ／过滤水的体积）。
９废弃物处理和防止污染的措施
检测过程中防止交叉污染的措施参见附录Ｂ。

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附录犃
（规    范    性    附录   ）
培    养    基    和    试剂

犃．１一般要求
为保证培养基的质量，宜按照ＳＮ／Ｔ１５３８．１和ＳＮ／Ｔ１５３８．２对培养基进行质量控制。
犃．２缓冲酵母浸膏琼脂培养基（犅犆犢犈）
犃．２．１成分
酵   母   粉１０．０ｇ
琼   脂１２．０ｇ
活   性   炭２．０ｇ
α� 酮    戊    二酸   钾１．０ｇ
ＡＣＥＳ缓冲液
（犖 �２� 乙酰氨基 �２� 氨基乙磺酸）１０．０ｇ
氢   氧   化   钾２．８ｇ
Ｌ� 盐   酸   半   胱氨   酸０．４ｇ
焦   磷   酸   铁０．２５ｇ
蒸   馏   水１０００ｍＬ
犃．２．２制备
犃．２．２．１半胱氨酸和铁盐溶液
制备新鲜的   Ｌ� 盐   酸   半   胱   氨   酸   和   焦   磷   酸   铁   溶   液   ：称   取   半   胱   氨   酸   和   铁   盐   ０．４ｇ和   ０．２５ｇ分   别   加   到１０ｍＬ蒸馏水   中   。   溶   液   通   过   孔   径   为   ０．２２ μ ｍ的   纤   维   素   酯   滤   膜   过   滤   灭   菌   。   －２０ ℃ 存   贮   于   灭   菌   容   器   中，时间不超过３个月。
犃．２．２．２犃犆犈犛缓冲液
犖 �２� 乙酰氨基 �２� 氨基乙磺酸加到５００ｍＬ蒸馏水中，４５ ℃ ～５０ ℃ 水浴溶解。称取氢氧化钾于
４８０ｍＬ蒸馏水中，混匀至溶解。混合以上两种溶液即为ＡＣＥＳ缓冲液。
犃．２．２    ．３培养基
活   性   酵   母   浸   膏   和   α� 酮   戊   二   酸   连   续   地   加   入   到   ９８０ｍＬ的    ＡＣＥＳ缓   冲   液   中   。０．１ｍｏｌ／Ｌ氢   氧   化   钾
（５．６ｇ＋１Ｌ蒸   馏   水   ），０．１ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４（５．３ｍＬ＋１Ｌ蒸   馏   水   ）。   用   以   上   两   种   溶   液   调   整   培   养   基   的   ｐＨ
至６．８ ± ０．２。加入琼脂，１２１ ℃ ，１５ｍｉｎ高压灭菌。５ ℃ 避光保存于密闭容器内，不超过４个星期。
犃．３缓冲酵母浸膏琼脂培养基（犅犆犢犈�犆狔狊）
配制见第Ａ．２章，不加Ｌ� 半胱氨酸。
犃．４选择性培养基（犌犞犘犆培养基）

注：ＧＶＰＣ培养基是在ＢＣＹＥ培养基中添加了三种抗生素和甘氨酸。
犃．４    ．１成分
游   离   的   氨   基   甘   氨   酸３ｇ／Ｌ
硫   酸   多   粘   菌   素    Ｂ（多   肽   类   抗   生   素   ）８００００ＩＵ／Ｌ
万   古   霉   素０．００１ｇ／Ｌ
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放   线   菌   酮０．０８ｇ／Ｌ
放线菌酮也可用那他霉素代替。
犃．４．２制备
犃．４．２．１抗生素的制备
称取硫   酸   多   粘   菌   素   Ｂ２００ｍｇ加   入   到１００ｍＬ的   蒸   馏   水   中   ，使   其   终   浓   度   为１４５４５ＩＵ／ｍＬ。混   合   。通过孔径   为   ０．２２ μ ｍ的   纤   维   素   酯   滤   膜   过   滤   灭   菌   。   吸   取   ５．５   ｍＬ于   灭   菌   容   器   中   ，储   存   于   －２０ ℃ 。   使   用   时室温溶解   。   称   取   适   量   的   万   古   霉   素   ２０ｍｇ加   入   到   ２０ｍＬ的   蒸   馏   水   中   ，混   合   。   通   过   孔   径   为   ０．２２ μ ｍ的   纤   维素酯   滤   膜   过   滤   灭   菌   。   吸   取   ５．５   ｍＬ于   灭   菌   容   器   中   ，储   存   于   －２０ ℃ 。   使   用   时   室   温   溶   解   。   称   取   适   量   的   放    线菌酮２ｇ加入到１００ｍＬ的蒸馏水中，混合。通过孔径为０．２２ μ ｍ的纤维素酯滤膜过滤灭菌。吸取
４ｍＬ于灭菌容器中，储存于－２０ ℃ 。使用时室温溶解。抗生素溶液冷冻保存 * 长时间为６个月。
注：放线菌酮对肝脏有毒害，称量其粉末时要戴橡胶手套和防尘面罩。
犃．４．２    ．２犌犞犘犆培养基的配制
按照Ａ．１配制ＢＣＹＥ培养基的步骤进行，在加过 α� 酮戊二酸后添加３．０ｇ甘氨酸氨盐，调ｐＨ到
６．８ ± ０．２。添加Ｌ� 半胱氨酸和铁以后，各添加Ａ．４．２．１中三种抗生素５．５ｍＬ、５．５ｍＬ和４ｍＬ，混合。
犃．５血   平板

犃．５    ．１成分
豆   粉   琼   脂（ｐＨ７．４～７．６）１００ｍＬ
脱   纤   维   羊   血   （或   兔血   ）５ｍＬ～１０ｍＬ
犃．５    ．２制备
加热   溶   化   琼   脂   ，冷   到   ５０ ℃ ，以   灭   菌   手   续   加   入   脱   纤   维   羊   血   ，摇   匀   ，倾   注   平   板   。   亦   可   用   其   他   营   养   丰   富   的基础培养基配制血琼脂。

犃．６酸缓冲液

犃．６    ．１成分
盐   酸０．２ｍｏｌ／Ｌ
氯   化   钾０．２ｍｏｌ／Ｌ
犃．６    ．２制备
犃．６   ．２    ．１溶液Ａ：０．２ｍｏｌ／Ｌ盐酸
在１Ｌ蒸馏水中添加１７．４ｍＬ（ρ ＝１．１８，３５．４％）或是２０ｍＬ（ρ ＝１．１６，３１．５％）浓盐酸。混合，
１２１ ℃ 高压灭菌１５ｍｉｎ。
犃．６   ．２    ．２溶液Ｂ：０．２ｍｏｌ／Ｌ氯化钾
在１Ｌ蒸馏水中溶解１４．９ｇ氯化钾，混合，在１２１ ℃ 高压灭菌１５ｍｉｎ。
犃．６   ．２    ．３制备酸缓冲液：混合３．９ｍＬ溶液Ａ和２５ｍＬ溶液Ｂ制备酸缓冲液，用１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钾调
ｐＨ到２．２ ± ０．２，用带塞的玻璃溶液保存。在黑暗状态下室温放置不超过１个月。
犃．７犘犪犵犲’盐犃．７．１成分
氯   化   钠０．１２０ｇ
七   水   硫   酸   镁０．００４ｇ
二   水   氯   化   钙０．００４ｇ
磷   酸   氢   二   钠０．１４２ｇ
磷   酸   二   氢   钾０．１３６ｇ
６

犛犖／犜２５２８ — ２０１０

双   蒸   水１０００ｍＬ
犃．７    ．２制备
将上述   化   学   试   剂   添   加   到   蒸   馏   水   中   ，溶   解   、混   合   ，在   １２１ ℃ 高   压   灭   菌   １５ｍｉｎ。   为   精   确   称   量   以   上   化   学试剂，先制备１０Ｌ盐溶液，然后分装成小体积灭菌。
犃．８犜犃犈电泳储备液（× ５０）

Ｔｒｉｓ２４．２ｇ
冰   乙   酸５．７ｍＬ
０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）１０．０ｍＬ
加   蒸   馏   水定容至１００ｍＬ
使用时稀释成１ × 电泳缓冲液。

犛犖／犜２５２８ — ２０１０

附录犅
（资    料    性    附录   ）
检   测   过   程   中   防   止   交   叉   污   染   的   措   施

犅．１抽样和制样过程
抽样和制样工具，应清洗干净，１２１ ℃ 高压灭菌１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ，一套洁净工具限于一份样品使用。
存放样品的容器应该经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。

犅．２检测过程
犅．２    ．１ＰＣＲ实   验   室   应   分   为   样   品   制   备   区   、前   ＰＣＲ区   、ＰＣＲ区   和   后   ＰＣＲ区   。   将   模   板   提   取   、ＰＣＲ反   应   液   配制、ＰＣＲ循   环   扩   增   及   ＰＣＲ产   物   的   鉴   定   等   步   骤   分   区   或   分   室   进   行   。   实   验   室   的   运   作   应   从   “ 洁   净   ” 到   “ 污   染   区   ” 单向进行。
犅．２    ．２实验过程中，应穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。
犅．２    ．３各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。
犅．２      ．４                 所   有   溶   液   、水   、耗   材   和   器   具   要   １２１ ℃ ，１５ｍｉｎ高   压   ，避   免   核   酸   和（或）核   酸   酶   污   染   。   每   种   溶   液   应使用高质   量   的   成   分   和   新   蒸   馏   的   双   蒸   水   。在２０ ℃ ～２５ ℃ 贮   存   的   试   剂   中   ，可   加   入０．０２５％的   叠   氮   钠   。所   有   试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。
犅．２    ．５ＤＮＡ模板或引物的离心管打开之前，要短暂离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。
犅．２    ．６前ＰＣＲ区中，* 好能在ＰＣＲ操作箱中加入ＰＣＲ反应各组分。
犅．２    ．７实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的ＤＮＡ。
犅．２    ．８可使用ＵＤＧ和ｄＵＴＰ系统控制污染。
犅．２    ．９应遵循ＰＣＲ操作的其他要求。