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GB 4789.43-2016酶制剂抗菌活性测试用菌

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   食品安全国家标准

 
   食品微生物学检验微生物源酶制剂抗菌活性的测定
 
 
4.2 大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC11229。
 
4.3 蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)ATCC2。
 
4.4 环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)ATCC4516。
 
4.5 化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)ATCC12344。 4.6 粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)ATCC14041。
 
5 检验程序
 
微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序见图1。
 
 
 
6 操作步骤
 
6.1 试验菌悬液原液制备
 
将金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠埃希氏菌(ATCC11229)、蜡样芽孢杆菌(ATCC2)、环状芽孢杆菌(ATCC4516)、化脓性链球菌(ATCC12344)、粘质沙雷菌(ATCC14041)冻存菌株分别接种于盛有5mLTSB的试管,置36℃±1℃培养18h~24h进行第一次传代培养,分别挑取第一次传代培养液1~2环转种于5mLTSB肉汤,置36℃±1℃培养18h~24h进行二次传代培养,作为试验菌悬液原液备用。
 
试验菌悬液原液纯度检测:分别挑取试验菌悬液原液各一环,划线接种于 TSA 平板,36 ℃±1 ℃
 
培养20h~24h,观察纯度。
 
6.2 菌悬液原液浓度测定
 
6.2.1 菌悬液原液稀释
 
分别取6.1中制备的菌悬液原液依次进行十倍梯度稀释,蜡样芽孢杆菌和环状芽孢杆菌分别制成10-4稀释液,金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、化脓性链球菌、粘质沙雷菌分别制成10-5稀释液。
 
6.2.2 培养计数
 
分别吸取6.2.1中制备好的各菌稀释液1mL于无菌平皿内,每个稀释度做两个平行,并用无菌生
 
理盐水作空白对照。向平皿中倾注冷却至46℃左右(可放置于46℃±1℃的恒温水浴箱中保温)的平板计数琼脂15mL~20mL,并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后,将平板翻转,于36℃±1℃培养24h后计数,各菌悬液原液中菌浓度均大于106 CFU/mL时方可使用。
 
6.3 检测平板制备
 
倾注融化并冷却至46℃±1℃的 TSA培养基 15mL于无菌培养皿内,待其凝固后制成 TSA 平板,备用。
 
将6.1中二次传代后的各菌培养物分别用冷却至46℃±1℃的 TSA 培养基按1∶10的比例稀释(其中化脓性链球菌 ATCC12344按1∶20的比例稀释),充分混匀后各取10mL至上述已制备好、于46℃±1℃中保温的 TSA平板内,轻轻摇动平板使菌液均匀铺平,待其凝固后制成检测平板,备用。
 
注:为防止含菌培养基遇到TSA后马上凝固,引起菌悬液铺板不均匀,菌悬液铺板前应事先将TSA平板置于46℃± 1℃条件下保温平衡10min。
6.4 酶制剂纸片的制备
 
准确称(移)取1.0g(mL)酶制剂于9mL无菌生理盐水中,充分混匀后制成10%的酶制剂溶液。将无菌纸片放入无菌平皿内,在每张纸片上缓缓滴加100μL10%的酶制剂溶液,使其全部吸收,每种酶制剂样品制备12张纸片。
 
6.5 贴纸片及培养
 
将6.4中制备的含待测酶制剂的纸片、含环丙沙星的阳性对照纸片(见 A.7)和含100μL无菌生理盐水的空白阴性对照纸片用无菌镊子分别置6.3中制备的检测平板上,每个平板贴2张纸片(2张含待
 
测酶制剂的纸片或2张含环丙沙星的纸片或2张空白纸片),两纸片圆点的间距大于32mm,每个标准菌株分别设一阳性对照和一阴性对照平板。将平板正置于4℃±0.5℃冰箱内过夜(12h~16h)。第
 
二天转入36℃±1℃恒温培养箱中培养24h后,测定酶制剂样品、环丙沙星和阴性对照纸片形成的抑菌圈。
 
7 抗菌活性结果报告
 
7.1 结果判定
 
若待测酶制剂对3种或3种以上受试微生物呈现出抗菌活性,即纸片周围出现清晰可见的抑菌圈
 
GB4789.43—2016
 
(每个抑菌圈直径≥16mm),且阳性对照环丙沙星纸片对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、粘质沙雷菌、
 
环状芽孢杆菌、化脓性链球菌5种细菌形成的抑菌圈均>16mm,则判定该酶制剂样品中存在抗菌活性物质。
 
7.2 结果报告
 
报告样品中检出抗菌活性或未检出抗菌活性。
 

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