甲基化是目前的研究热点,就我所做的一点工作并其中一点心得,与大家分享.希望能够对大家有所帮助.第一部分基因组DNA的提取.这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的.
此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者.蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml;RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml.否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了.两者均于-20度保存.
紫外分光光度计计算OD比值;1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳.我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰.
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出,所用双蒸水均经高压蒸汽灭菌.将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul;加5.5ul新鲜配制的3MNaOH;42℃水浴30min;10mM对苯二酚氢醌,加30ul至上述水浴后混合液中;溶液变成淡黄色.
3.6M亚硫酸氢钠,配制方法:1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3MNaOH滴定溶液至PH5.0,最终体积为5ml.这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心.PH一定要准确为5.0.加520ul至上述水浴后溶液中.
