紫外消毒30min后关闭紫外灯,开启超净台正常工作状态,用酒精消毒操作者的双手.将所需的培养基,胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内,点燃酒精灯,将培养基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后,再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次,旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖,分别放于酒精灯的两侧.特别是将培养基瓶放于斜架上,瓶口对准酒精灯,且放在距离酒精灯最近的位置,瓶盖置于酒精灯的另一侧
将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次,旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次,盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸,在酒精灯消毒2-3次瓶口,竖直放好.取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次,然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液,悬空移入培养瓶内
将培养使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层,计时约40s,立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙,并有1-2个细胞脱落,这时为胰酶消化的最适时机.若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度;若看不到针孔样缝隙和细胞脱落,则需继续消化,轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s后迅速竖起对着灯光观察细胞情况,可反复几次,直至出现针孔样缝隙和1-2个细胞脱落的最佳消化状态.用移液器将胰酶吸净
吸取1ml细胞冻存液于培养瓶内,并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次,使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次,使细胞尽可能处于单个悬浮状态.将1ml含有细胞的冻存液移入新的保种管内,拧紧瓶盖,做好实验标记
将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧,熄灭酒精灯,整理实验台面,取出实验试剂及污缸等,关闭超净工作台.将保种管先放于4℃冰箱30min后拿出放置-20℃冰箱过夜,次日再放于-80℃的冰箱内3-4天,最后存放于-196℃的液氮灌内长期保存
注此过程也可简化因实际操作过程中经验所得:步骤7结束后将保种管用干脱脂棉包裹后胶带封好直接放于-80℃冰箱内4-5天,即可放于液氮灌保存.但-80℃冰箱也可保存细胞株2-3月
