在细胞核中,DNA是环状附着在核基质上,细胞裂解过程中,核基质被溶解、抽提,DNA的结构则未发生变化.如果DNA链上存在缺口,则使DNA超螺旋变的松弛,DNA环向外展,同时由于暴露了阴电荷,在电场力的作用下,松动的DNA环向阳极迁移,但是由于这种松动的DNA环一端仍附着于核DNA,其迁移距离受到限制,因此尾长并不总是真实反映链缺口的多少.实际应当依靠尾长与尾部的荧光强度同时来进行分析.
离制备单细胞悬液:体外培养的细胞株:用胰酶消化,吹打成单细胞悬液;体内脏器细胞:处死动物,取出脏器,于Hanks’液中制备成单个细胞悬液.取20~50μl于56℃水浴中保温的0.5%普通熔点琼脂糖,铺于磨沙载玻片上,形成底胶.
取100~150μl0.5%普通熔点琼脂糖加在底胶上,再于其上加盖玻片,4℃冷凝10分钟.取下盖片,取50~100μl于37℃水浴中保温的1.0%的低熔点琼脂糖与50~100μl细胞悬液(105个细胞/ml)混匀,立即铺片,加上盖玻片,4℃冷凝10分钟.去掉盖玻片,取70~100μl于37℃水浴中保温的0.5%的低熔点琼脂糖铺片,加盖玻片,4℃冷凝.
将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于4℃预冷的细胞裂解液中,4℃裂解1小时.取出胶板,放入电泳槽中,浸泡在电泳液中解旋20分钟.4℃电泳20分钟(25V,300mA).电泳结束,将胶板浸泡于中和液中,每次15分钟,共中和两次,注意更换中和液.
